Sangue

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 517 (2023) Citare questo articolo

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Il Dermanyssus gallinae è un acaro ematofago che parassita gli uccelli selvatici e il pollame d'allevamento. La sua straordinaria rapidità di elaborazione del sangue, insieme alla capacità di nutrirsi di sangue durante la maggior parte degli stadi di sviluppo, rendono questo acaro un parassita altamente debilitante. Per identificare adattamenti specifici alla digestione di una dieta ricca di emoglobina, abbiamo costruito e confrontato i trascrittomi degli stadi affamati e nutriti con sangue del parassita e identificato le trascrizioni arricchite dell'intestino medio. Abbiamo notato che le trascrizioni dell'intestino medio che codificano per le proteasi della cisteina erano sovraregolate con un pasto di sangue. Mappando l'intero apparato proteolitico, abbiamo notato una riduzione della suite di proteasi della cisteina, omologhi mancanti per la catepsina B e C. Abbiamo ulteriormente identificato e analizzato filogeneticamente tre distinte trascrizioni che codificano per le vitellogenine che facilitano la capacità riproduttiva degli acari. Abbiamo anche mappato completamente le trascrizioni per la biosintesi dell'eme e il sistema basato sulla ferritina di stoccaggio del ferro e del traffico intertissutale. Inoltre, abbiamo identificato trascritti che codificano per proteine implicate nella segnalazione immunitaria (vie Toll e IMD) e nell'attività (difensine e proteine contenenti tioestere), RNAi e canalizzazione ionica (con bersagli per acaricidi commerciali come Fluralaner, Fipronil e Ivermectina). Le sequenze virali sono state filtrate dalle letture Illumina e abbiamo descritto, in parte, l'RNA-viroma di D. gallinae con l'identificazione di un nuovo virus, Red mite quaranjavirus 1.

Gli acari Dermanyssus sono ectoparassiti ematofagi degli uccelli1. L'acaro rosso del pollame (D. gallinae) è un parassita globale delle ovaiole per la produzione di uova sia domestica che ad alta intensità commerciale2,3,4, parte di un mercato globale importante e in continua crescita5. Gli acari D. gallinae hanno un ciclo vitale molto breve, passando dallo stadio giovanile a quello adulto maturo entro una settimana. La necessità di nutrirsi con sangue per la maggior parte degli stadi di sviluppo e la rapida dinamica riproduttiva rendono D. gallinae un parassita altamente irritante e fastidioso. Durante l'alimentazione con sangue, gli acari D. gallinae possono trasmettere diversi importanti agenti patogeni animali ai loro ospiti6, inclusi alcuni zoonotici7. Sebbene sia stato riscontrato un gran numero di virus e batteri associati a D. gallinae, la sua capacità di agire come vettore o serbatoio è stata supportata sperimentalmente solo per pochi agenti patogeni8,9,10. Ciò è particolarmente allarmante per la trasmissione di Salmonella spp.10, che causa la salmonellosi associata alle uova e la malattia tifoide dei volatili11, nonché la diffusione del virus dell'influenza aviaria A12. D. gallinae è stata associata anche a diverse altre specie batteriche e virali, con prove in attesa di conferma sperimentale della sua capacità vettoriale2,10,13,14.

Nonostante la conoscenza generale dell’impatto globale dell’infestazione da acari sul benessere delle galline nella produzione di deposizione delle uova, la nostra comprensione dei processi molecolari che consentono un’alimentazione sanguigna rapida e ripetitiva, la digestione del sangue, lo sviluppo e la riproduzione rimane scarsa. Precedenti studi di trascrittomica hanno descritto i trascrittomi di interi corpi di acari D. gallinae, per lo più in modo specifico per lo stadio di sviluppo o lo stato di alimentazione15,16,17,18. Per aumentare ulteriormente le nostre conoscenze, abbiamo mirato a identificare le trascrizioni specifiche dell'intestino medio che codificano per proteine che sono fondamentali per il successo dell'alimentazione del sangue e della digestione. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo confrontato trascrittomi appena sequenziati e assemblati, con successiva selezione di trascrizioni arricchite negli acari alimentati con sangue rispetto a quelli non alimentati, con chiara espressione specifica dell'intestino. Particolare attenzione è stata prestata ai processi inerenti al successo degli alimentatori di sangue, compresa la digestione enzimatica delle proteine del sangue ospite, la biologia dell'eme e del ferro, la vitellogenesi e l'immunità innata. I dati RNA-seq sono stati quindi verificati mediante RT-qPCR su set di cDNA preparati da più repliche biologiche indipendenti. Inoltre, abbiamo integrato l'analisi dei dati RNA-seq con diversi test biologici, in cui inibitori di piccole molecole sono stati introdotti nell'acaro mediante alimentazione di membrana ex vivo o microiniezione nel suo emocele per comprendere l'importanza di molecole e percorsi selezionati. Inoltre, le letture Illumina dell'origine virale sono state filtrate e utilizzate per un assemblaggio parziale del viroma dell'RNA dell'acaro.

54 M reads with Phred Scores of Q30 ≥ 93.90% were obtained, and these were assembled into 85,117 contigs (Supplementary Table S1). Following their annotation, bacterial contaminants were removed (Supplementary Table S2). As D. gallinae mites were fed chicken blood, consisting of nucleated white and red cells, 4% of total reads were of chicken origin, out of which (79%) were found, as expected, in the midgut transcriptome (Supplementary Fig. S1). The identified chicken sequences were filtered out and excluded from the following analyses. A total of 18,101 D. gallinae-specific contigs were deposited at the NCBI server as BioProject PRJNA597301 and Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) GIFZ00000000 and are accessible through NCBI BLAST of the TSA database. The contigs are also listed in a hyper-linked Excel sheet (see "Data availability") with available encoded predicted protein characteristics, annotations of assembled contigs according to a particular database, differential expression statistics, and predicted cellular processes. To assess the completeness of the transcriptome, we ran a BUSCO analysis of the proteome, the result of which exhibited a yield of 91.8% complete BUSCOs. The heat map generated from D. gallinae-specific contigs clearly indicated differences between transcriptomes of immature and adult stages and also highlighted differences in the abundance of transcripts in blood-fed over unfed mites (Supplementary Fig. S1)./p>16× FPKM values over unfed protonymphs and with transcripts of FPKM ≥ 1 in midguts. b The bar graph shows protein classes encoded by individual transcripts enriched by blood-feeding. Transcripts were sorted according to encoded protein class. The number of transcripts from each subclass and their FPKM values are shown. c The table shows top differentially expressed transcripts (DET) enriched, >16× FPKM values, in transcriptomes of blood-fed protonymphs (FP) over transcriptomes of unfed protonymphs (UP). Individual accession IDs are available in Supplementary Table S3. c’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (c). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of unfed and blood-fed mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. d The table shows DETs enriched in transcriptomes of midguts over transcriptomes of whole bodies, with filters applied: Eval < e−60, coverage ≥ 90%, FPKMAdults ≥ 2. Individual accession IDs are available in Supplementary Table S4. d’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (d). Data were obtained from cDNA sets synthesised from at least four independent RNA isolates of adult females and micro-dissected midguts of adult females (n ≥ 4) and normalised to ef1α. Means and SEMs are shown. t-Test analyses: *p = 0.05–0.01; **p = 0.01–0.001; ***p = 0.0008; ****p < 0.0001; n.s. not significant. For the source data behind the graphs, see Supplementary Data S1./p>

16× FPKM values in the transcriptome of adults over transcriptomes of both mite juvenile stages, protonymphs and deutonymphs; and E-value < e−80; protein IDs are available as Supplementary Table S7. b’ RT-qPCR validation of DETs identified by RNA-seq data shown in panel (b). Data were obtained from cDNA sets synthesised from three independent RNA isolates of adult and juvenile mites (n = 3) and normalised to elongation factor 1 (ef1α). Means and SEMs are shown. For the source data behind the graph, see Supplementary Data S1. FP fed protonymphs, FD fed deutonymphs. c Maximum likelihood phylogeny of 94 arthropod vitellogenin amino acid sequences showing the positioning of three D. gallinae vitellogenin homologues within the Vg1 and Vg2 lineages. Crustacean vitellogenins were used as an outgroup. Nodal supports at the main nodes are represented by maximum likelihood bootstrap values and Bayesian inference posterior probabilities, respectively. For simplification, the homologues from non-parasitiform taxa were collapsed into triangles; numbers inside the triangle indicate the number of sequences included in each clade. For GenBank accession numbers, see Supplementary Table S8./p>

16 fold over its FPKM values in the transcriptome of FP, and at the same time, in the transcriptome of fed deutonymphs (see "Data availability"). In order to list transcripts enriched in the transcriptome of fed over UP, only transcripts with clear annotations (E-value < e−100), coverage > 10%, and FPKM in FP > 5 were considered. The transcripts were then listed according to the highest fed/unfed ratios./p>

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