Identificazione della lignocellulosa fungina

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1254 (2022) Citare questo articolo

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La profilazione proteica basata sull'attività (ABPP) è emersa come un metodo biochimico versatile per studiare l'attività enzimatica in varie condizioni fisiologiche, con applicazioni finora principalmente in biomedicina. Qui, mostriamo il potenziale dell'ABPP nella scoperta di biocatalizzatori dal fungo del marciume bianco termofilo e degradante della lignocellulosa Phanerochaete chrysosporium. Utilizzando uno schermo funzionale comparativo basato su ABPP, inclusa una profilazione diretta degli enzimi legati al substrato del legno, identifichiamo le carboidrato esterasi che degradano la lignocellulosa (CE1 e CE15) e la glicoside idrolasi (GH3, GH5, GH16, GH17, GH18, GH25, GH30, GH74 e GH79) enzimi specificatamente attivi in ​​presenza del substrato. Poiché l’espressione degli enzimi fungini rimane impegnativa, il nostro approccio mediato da ABPP rappresenta una procedura di preselezione per concentrare gli sforzi sperimentali sui biocatalizzatori più promettenti. Inoltre, questo approccio può anche consentire l'annotazione funzionale di funzioni di domini sconosciuti (DUF). Lo screening dei biocatalizzatori basato su ABPP qui descritto può quindi consentire l'identificazione di enzimi attivi in ​​un processo di interesse e la delucidazione di nuovi biocatalizzatori che non condividono alcuna somiglianza di sequenza con controparti note.

La profilazione proteica basata sull'attività (ABPP) è emersa come una metodologia di proteomica chimica ampiamente utilizzata per la ricerca biologica di base1,2,3,4,5. Nell'ABPP, le sonde basate sull'attività (ABP) sono costituite da una "testata" reattiva, una porzione enzimatica inibitoria che forma un legame covalente irreversibile con le proteine ​​bersaglio e spesso garantisce un'elevata specificità della classe enzimatica, un linker e un reporter i tag vengono utilizzati per etichettare, identificare e segnalare gli enzimi attivi in ​​condizioni fisiologiche native. Come reporter vengono spesso utilizzati biotina, fluorofori o i cosiddetti tag reporter a due fasi come le porzioni alchiniche o azidiche6. Negli ultimi anni sono stati intrapresi intensi sforzi, sia per sviluppare nuovi ABP mirati a nuove famiglie di enzimi, sia per stabilirne l'uso, tra gli altri, nella scoperta di farmaci (scoperta di target e lead, coinvolgimento del target)7,8,9,10,11 ,12, biologia vegetale13 o microbiologia14,15,16,17,18.

Un'applicazione alternativa dell'ABPP in evoluzione è il suo utilizzo nello screening dei biocatalizzatori e, quindi, nella biotecnologia (qui definiamo biocatalizzatori come enzimi con potenziale utilizzo industriale)19,20,21. Ad esempio, l’ABPP può essere utilizzato per scoprire biocatalizzatori microbici in grado di trasformare biomasse polimeriche complesse come la lignocellulosa, entità molto ricercate nel contesto dell’energia sostenibile e dei processi di bioeconomia circolare22,23,24. In contrasto con gli approcci di screening dei biocatalizzatori basati sull'omologia di sequenza (ad esempio, l'analisi dei dati genomici25), l'ABPP sfrutta la consolidata selettività enzimatica degli ABP per identificare nuovi biocatalizzatori con preferenze di substrato desiderabili, in linea di principio, senza la necessità di assegnare omologie di sequenza (Fig 1a)26,27. In quello che viene definito "arricchimento basato su ABP", solo gli enzimi che sono attivi e quindi hanno la capacità di reagire con un ABP vengono selezionati per la successiva identificazione mediante sequenziamento basato su LC-MS/MS, che limita l'identificazione delle proteine ​​in base al target specificità degli SOA utilizzati. Di conseguenza, l’espressione e la purificazione delle proteine ​​biochimiche, spesso complesse, sono limitate solo ai biocatalizzatori preselezionati dall’ABPP: un’enorme riduzione del lavoro rispetto ai metodi di screening che si basano su espressioni proteiche sistematiche. Ciò è particolarmente rilevante nelle campagne di screening di biocatalizzatori fungini, che sono spesso ostacolate dalla difficile espressione e purificazione delle proteine ​​eterologhe, ad esempio, a causa di complessi modelli di glicosilazione nel caso degli enzimi che degradano il legno28,29. Nonostante questi progressi intrinseci, la scoperta di biocatalizzatori basati su ABPP è stata applicata principalmente in studi di prova utilizzando colture pure, spesso di organismi modello e, cosa più importante, terreni di coltura standard per la loro crescita30,31,32,33,34 .