Il fumarato induce il rilascio vescicolare del mtDNA per stimolare l'immunità innata

Natura volume 615, pagine 499–506 (2023) Citare questo articolo

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Le mutazioni della fumarato idratasi (FH) causano leiomiomatosi ereditaria e carcinoma a cellule renali1. La perdita di FH nel rene suscita diverse cascate di segnali oncogenici attraverso l'accumulo dell'oncometabolita fumarato2. Tuttavia, sebbene siano state descritte le conseguenze a lungo termine della perdita di FH, la risposta acuta non è stata finora studiata. Qui abbiamo generato un modello murino inducibile per studiare la cronologia della perdita di FH nel rene. Mostriamo che la perdita di FH porta ad alterazioni precoci della morfologia mitocondriale e al rilascio di DNA mitocondriale (mtDNA) nel citosol, dove innesca l'attivazione della GMP-AMP sintasi ciclica (cGAS) – stimolatore dei geni dell'interferone (STING) – TANK-binding chinasi 1 (TBK1) e stimola una risposta infiammatoria che dipende anche parzialmente dal gene I inducibile dall'acido retinoico (RIG-I). Meccanicisticamente, mostriamo che questo fenotipo è mediato dal fumarato e si verifica selettivamente attraverso vescicole di derivazione mitocondriale in un modo che dipende dallo smistamento della nexina 9 (SNX9). Questi risultati rivelano che livelli aumentati di fumarato intracellulare inducono un rimodellamento della rete mitocondriale e la generazione di vescicole derivate dai mitocondri, che consentono il rilascio di mtDNA nel citosol e la successiva attivazione della risposta immunitaria innata.

La fumarato idratasi (FH), un enzima metabolico del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) che catalizza la conversione reversibile del fumarato in malato, è stato identificato come un autentico soppressore del tumore2. La perdita di FH predispone alla leiomiomatosi ereditaria e al carcinoma a cellule renali (HLRCC), una sindrome caratterizzata da una forma aggressiva di cancro del rene. Un segno distintivo sia delle cellule carenti di FH che dei tumori è l'accumulo aberrante di fumarato3, che ha dimostrato di guidare la trasformazione maligna e la progressione del tumore attraverso l'attivazione di una serie di cascate oncogene2. Tuttavia, quando analizzate in tumori o altri modelli cellulari, tutte queste cascate di segnalazione sono già attivate simultaneamente ed è probabile che siano intrecciate, il che rende difficile chiarirne la gerarchia, la comunicazione incrociata e il contributo causale alla malattia.

Qui abbiamo generato un modello murino transgenico inducibile per studiare la cronologia della perdita di Fh1, l'ortologo murino dell'FH umano, nel rene adulto. Incrociando un ceppo Fh1fl/fl4 precedentemente generato con topi che contengono una ricombinasi Cre inducibile dal tamoxifene espressa in modo ubiquitario nel locus5 Rosa26, abbiamo ottenuto un ceppo Fh1fl/fl inducibile dal tamoxifene (Fig. 1a). Il trattamento dei topi Fh1fl/fl con tamoxifene ha portato all'escissione efficiente degli esoni 3 e 4 di Fh1 (di seguito denominati Fh1−/−), rispetto al ceppo di controllo (Fh1+/+) (Fig. 1b e Dati estesi Fig. 1a,b) . La perdita di FH provoca profondi cambiamenti metabolici, compreso l'accumulo intracellulare aberrante di argininosuccinato6 e di prodotti della reazione mediante la quale il fumarato si aggiunge ai gruppi tiolici della cisteina libera e ai gruppi tiolici delle proteine7, generando S-(2-succinil)cisteina (2SC) e proteine ​​succinate, rispettivamente. Entrambe le reazioni tamponano l'eccesso di produzione di fumarato, che alla fine si verifica quando questi e altri sistemi tamponanti hanno raggiunto la capacità (Dati estesi Fig. 1c). Abbiamo osservato un aumento precoce di 2SC al giorno 5, seguito da un aumento di tutti questi marcatori metabolici, incluso il fumarato, al giorno 10 nei reni Fh1−/− (Fig. 1c). Macroscopicamente, non c'erano differenze morfologiche grossolane tra i reni wild-type e quelli carenti di Fh1 (Fig. 1d).

a, Strategia di modifica del genoma per generare alleli knockout Fh1 inducibili. I topi Rosa26-Cre-ERT2 trasportano il transgene ricombinasi Cre sensibile al tamoxifene a valle del promotore Rosa265. I topi Fh1fl/fl13 contengono due siti loxP che fiancheggiano gli esoni 3 e 4 di Fh1. L'iniezione intraperitoneale di tamoxifene nel topo adulto induce la traslocazione nucleare della proteina di fusione Cre-ERT2 espressa ubiquitariamente, con conseguente escissione del frammento genomico situato tra i siti loxP per generare alleli nulli Fh1 (Fh1−/−). Topi di circa 90 giorni di età vengono trattati con tamoxifene e i reni vengono raccolti per l'analisi al giorno 5 e al giorno 10 dopo l'iniezione. b, livelli di espressione dell'mRNA di Fh1 nei reni di topo adulto di controllo wild-type (Fh1+/+) e carenti di Fh1 (Fh1−/−), misurati mediante qRT-PCR. c, Abbondanza di metaboliti (intensità ionica di picco normalizzata, unità arbitrarie (AU)) nel rene di topo adulto Fh1+/+ e Fh1−/− misurato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC–MS). d, Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) del rene di topo adulto Fh1+/+ e Fh1−/− al giorno 10 dopo l'induzione. Barre di scala, 100 μm. e, Grafici vulcanici del GSEA, che evidenziano i percorsi regolati in modo differenziale nel tessuto renale Fh1−/− rispetto a Fh1+/+ al giorno 10 dopo l'induzione. FDR, tasso di false scoperte; NES, punteggio di arricchimento normalizzato. f, Mappa termica che mostra geni correlati all'infiammazione sovraregolati nel tessuto renale Fh1−/− rispetto a Fh1+/+ al giorno 5 e al giorno 10 dopo l'induzione (i globuli bianchi non indicano alcuna differenza tra i due gruppi). g, Livelli di espressione degli ISG nel tessuto renale Fh1−/− rispetto a Fh1+/+ al giorno 5 e al giorno 10 dopo l'induzione, misurati mediante qRT–PCR. I dati sono medi ± sem b,c,g, n = minimo 8 topi in ciascun gruppo, test t di Student corretto per confronti multipli con il metodo Holm-Sidak.