Quantificazione della fissazione biologica dell'azoto mediante Mo

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 22011 (2022) Citare questo articolo

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La fissazione biologica dell'azoto (BNF) da parte del molibdeno canonico e delle isoforme complementari del vanadio e della sola nitrofasi del ferro è la fonte naturale primaria di azoto appena fissato. Comprendere i controlli sul ciclo globale dell’azoto richiede la conoscenza dell’isoforma responsabile del BNF ambientale. Il test di riduzione isotopica dell'acetilene (ISARA), che misura il frazionamento dell'isotopo stabile del carbonio (13C/12C) tra etilene e acetilene nei test di riduzione dell'acetilene, è uno dei pochi metodi in grado di quantificare i flussi BNF isoforma-specifici. L'applicazione dell'ISARA classica è stata impegnativa perché l'attività ambientale del BNF è spesso troppo bassa per generare etilene sufficiente per le analisi isotopiche. Qui descriviamo un metodo ad alta sensibilità per misurare l'etilene δ13C mediante accoppiamento in linea della preconcentrazione di etilene alla spettrometria di massa del rapporto gascromatografia-combustione-isotopo (EPCon-GC-C-IRMS). I requisiti di etilene nei campioni con il 10% v/v di acetilene sono ridotti da > 500 a ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv previa rimozione dell'acetilene offline). Per aumentare la robustezza riducendo l'errore di calibrazione, i mutanti di Azotobacter vinelandii dell'isoforma singola della nitroasi e i test sui campioni ambientali si basano su una fonte comune di acetilene per la produzione di etilene. L'applicazione del metodo ISARA a bassa attività BNF (LISARA) a terreni a bassa attività di fissazione dell'azoto, lettiera di foglie, legno decomposto, crittogame e termiti indica BNF complementare nella maggior parte dei tipi di campioni, richiedendo ulteriori studi sul BNF isoforma-specifico.

L’azoto (N) stabilisce fondamentalmente i limiti della produttività biologica, probabilmente limitando le risposte degli ecosistemi naturali al cambiamento ambientale globale1,2,3. La fissazione biologica dell’azoto (BNF), il processo procariotico che converte il diazoto atmosferico (N2) in ammoniaca, è il principale input biologico di nuovo N biodisponibile per i bilanci globali e regionali di N. Svolge quindi una funzione biogeochimica chiave in diversi ecosistemi, tra cui foreste tropicali, temperate e ad alta latitudine, erba montana e arbusti, nonché ambienti bentonici e oceanici aperti4,5. La nitrogenasi, il metalloenzima responsabile del BNF, esiste in tre isoforme primarie, caratterizzate dal metallo di transizione presente nel sito attivo: la nitrogenasi canonica e quella "alternativa", o più recentemente definita "complementare" di solo vanadio (V) e ferro ( Nitrofasi solo Fe)6,7. Le nitrogenasi solo V e Fe sono Mo-indipendenti e contengono i più abbondanti metalli in traccia V e Fe di origine crostale al posto di Mo8.

Determinare il contributo delle diverse isoforme della azotosi al BNF ambientale è fondamentale per comprendere i controlli meccanicistici sul BNF dell’ecosistema, in particolare il modo in cui i cicli biogeochimici accoppiati di macronutrienti e metalli in traccia biologicamente attivi rispondono alle perturbazioni antropogeniche. Poiché i calcoli del tasso di BNF basati sui metodi tradizionali (ovvero, test di riduzione dell'acetilene e metodi di abbondanza naturale di 15N/14N) sono sensibili all'isoforma della nitroenzimatica9,10,11, l'errata attribuzione delle isoforme della nitrozoasi attive nel BNF può alterare le stime del budget di N di quanto fino al 50%12,13, influenzando lo stato e la gestione dell'ecosistema N.

La specificità del metallo dei flussi BNF ambientali può ora essere valutata con l'applicazione del monitoraggio del flusso specifico per isoforma tramite il test di riduzione isotopica dell'acetilene (ISARA) e metodi di resa in etano combinati con analisi della sequenza genica della nitrofasi6,12,13,14. Questi approcci hanno identificato contributi significativi di nitratosi complementari solo V e Fe al BNF non rizobico in diversi campioni che vanno dalla lettiera di foglie di mangrovie temperate dell'Everglade, ai sedimenti di paludi salmastre costiere temperate e ai cianolicheni boreali12,13,15,16. Più recentemente, uno studio sul BNF cianolico attraverso un gradiente nutritivo di una foresta boreale di 600 km ha fornito la prima prova su scala di ecosistema del ruolo della V-nitrogenasi nel sostenere gli input di BNF in condizioni limitate di Mo13, convalidando un'ipotesi di lunga data sul "backup" ruolo delle nitroasi complementari originariamente suggerito da studi di laboratorio17. Inoltre, bassi rapporti tra l'attività di riduzione dell'acetilene e dell'azoto (cioè rapporti R), suggestivi di BNF complementare, sono stati osservati per il suolo temperato9, il muschio boreale11,18 e il legno in decomposizione19. Inoltre, geni complementari e non caratterizzati della nitratosi sono stati rilevati nel pacciame di legno20, nell'intestino delle termiti21, nel suolo9, nel muschio22 e nei cianolicheni23,24. Questi studi, insieme all'accumulo di esempi di BNF limitato al Mo nei biomi delle foreste boreali18,25,26, temperate e tropicali27,28,29,30,31,32,33 suggeriscono che il BNF complementare e indipendente dal Mo potrebbe svolgere un ruolo globale. Tuttavia, la quantificazione dei tassi di BNF Mo-indipendenti nei campioni ambientali, che spesso hanno una bassa attività BNF, è stata impegnativa poiché il metodo più affidabile per l'attribuzione complementare del BNF, ISARA12, richiede rese di etilene molto più elevate di quelle tipicamente osservate (ad es., suolo, muschio , la lettiera fogliare genera tipicamente < 300 ppmv di etilene nel corso di incubazioni del test di riduzione dell'acetilene di 1-2 giorni). Uno studio più ampio del BNF complementare e dei suoi controlli all'interno di importanti ecosistemi richiede miglioramenti metodologici di ISARA.

500 ppmv). Secondly, acetylene measurements (δ13Cacetylene) often have large uncertainties due to peak tailing and memory effects, which necessitates frequent GC column conditioning (i.e., a brief increase of temperature to remove water, acetylene, and any other analytes accumulated on the column) and combustion reactor oxidations in which pure O2 is flushed into the reactor at high temperature to regenerate the reactor's oxidative capacity. Finally, ethylene and acetylene isotope measurements are calibrated to the VPDB international carbon isotope reference scale using methane isotope standards because no ethylene standards with NIST traceable δ13C values exist. Deviations in chemical behavior between the methane standard and target analytes, ethylene and acetylene, during chromatographic separation and combustion can lead to biases during drift correction along and across multiple sample runs comprised of replicate measurements. The classical ISARA method is thus relatively time-consuming and limited to samples with high BNF activity./p> 500 ppmv) in 10% v/v acetylene were manually injected into a Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink with an Agilent HP-PLOT/Q capillary GC column (30 m, i.d. = 0.32 mm, f.t. = 20 μm) and a combustion reactor connected to a Thermo Scientific Delta V Plus isotope ratio mass spectrometer (GC-C-IRMS; Fig. 1a). Modifications include the replacement of silver ferrules in the GC oven with Valcon polymide (graphite reinforced polymer) ferrules to limit memory effects from acetylene. The combustion reactor was oxidized with pure oxygen for 1 h before each run and brief (15 min) seed oxidations were performed between measurement batches (i.e., required every ~ 6–8 ethylene injections, ~ 4–6 acetylene injections) to regenerate reactor oxidation capacity and minimize drift of δ13C values. See Supplementary Table S1a online for additional instrument settings./p> 5000 ppmv (i.e., 5% of acetylene concentration), δ13Cethylene was also corrected for Rayleigh fractionation12,43./p> 100% (i.e., 100% FeNase is equivalent to ~ 140% VNase; Supplementary Table S4). Estimated uncertainty on the %FeNase scale is at most ~ 20%./p>

23.6 nmol C. The larger volume allowance of the EPCon autosampler (20 mL) relative to the GC-C-IRMS sample inlet port (≤ 1 mL) and increased sensitivity enables measurement of gases with ≥ 0.7 ppmv ethylene in the absence of background acetylene. The minimum ethylene concentration for samples with a background of 10% v/v acetylene (typical ARA samples) is 9 ppmv, or 2 ppmv if background acetylene is removed by chemical precipitation prior to EPCon analyses. Conservatively, minimum working ethylene concentrations for ARA samples are 500 ppmv (direct injection), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS), and 5 ppmv (chemical precipitation + EPCon-GC-C-IRMS). The lower sensitivity of the direct injection GC-C-IRMS method is partly due to the necessary use of a high split-ratio within the sample injector port (40:1 – the proportion of sample and He carrier gas flow that is vented from the injection port relative to the proportion that enters the GC column) to fully resolve ethylene (~ a few to several hundred ppmv) and acetylene (~ 100,000 ppmv) peaks with our capillary GC column./p> 5 V) apparent during δ13Cethylene analyses exacerbated peak tailing problems, causing decreased δ13Cethylene precision (by as much as 5‰). GC column and combustion reactor reconditioning was required when excess acetylene was inadvertently introduced into the GC-C-IRMS (e.g., incomplete venting within EPCon)./p> 160% in the %VNase scale and > 120% in the %FeNase scale must be strongly influenced by processes unrelated to BNF (e.g. natural endogenous ethylene cycling—production or consumption, gas leakage from stoppers). Non-BNF related fractionation may explain the > 160% VNase values observed for certain samples of litter (n = 1), moss (n = 1), soil (n = 4), decayed wood (n = 2)./p> 500 ppmv and the requirement for δ13Cacetylene measurements. Further, the offline precipitation step to completely remove acetylene from ARA sample headspace would enable any microbiology or wet-chemistry lab to outsource ISARA analyses of ethylene from sample and single nitrogenase calibration ARAs run with the same source acetylene to other stable isotope analytical laboratories for δ13Cethylene measurements. We note that the comparability of absolute δ13C values across research groups may vary and be difficult to assess as multiple factors (e.g., type of GC column and oxidation reactor state) can influence absolute δ13C values. This makes the simultaneous analyses of single nitrogenase calibration ARAs and environmental samples particularly important./p> 5% of the ARA produced ethylene concentration for a given sample type and location) in 12 out of 93 "no acetylene added" control samples. All 12 samples that contained endogenous ethylene were incubated for 290 to 300 h (27 samples were incubated for that long). Another batch of 27 samples incubated for 165 to 175 h did not show signs of endogenous ethylene production. Acetylene has been reported to inhibit ethylene oxidation, thus "no acetylene added" control samples might not be sufficient to assess endogenous ethylene production in ARAs with very low ethylene yield (< 20 ppmv)50. Thus, we recommend incubating samples for ideally less than 60 h when conducting an ISARA or LISARA surveys. Overall, the low endogenous ethylene production rate from our samples during incubations (Supplementary Table S3), and the similarity among isotopic signatures obtained for each sample type over four sites, 2 years, and various incubation times (2–300 h) indicates that natural ethylene cycling has minimal influence on our reported results./p>

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